技术分享丨金百合生物枯草芽孢杆菌BK5抗逆性、净水能力和抑菌试验报告
发布时间：
2025-07-07
01试验目的
评估金百合生物枯草芽孢杆菌BK5产品对不良条件的抗逆性、净化水质能力和抑菌能力，为产品的生产应用提供理论依据。
1、实验器材：电子天平、恒温培养箱、灭菌锅、超净工作台、游标卡尺、移液枪(1mL、200μL)、试管、锥形瓶、培养皿（90×90mm）、枪头(1mL、200μL)、医用棉签等。培养皿、枪头、离心管、棉签等需灭菌备用。
2、培养基：营养琼脂（NA）。
3、指示菌株：1株大肠杆菌临床分离菌株、1株沙门氏菌临床分离株、1株金黄色葡萄球菌ATCC6538、1株副溶血弧菌、1株嗜水气单胞菌、1株猪源产气荚膜梭菌。
4、待测样品：金百合生物1600亿枯草BK50725-801（FK5），为枯草BK5经复壮后保存的菌株制备的菌粉。
1、抗逆性试验：
1.1耐胃酸试验：试验设4个不同pH处理(1.5、2.5、3.5、4.5)，分别用1mol/L盐酸调节0.9%生理盐水至上述pH值。按照0.1%的接种量分别接种枯草芽孢杆菌菌粉，在37℃经150r/min摇床震荡培养。在接种初始及接种后30、60、90、120、150min取上述各处理中的菌液，80℃水浴加热10min，进行平板芽孢计数。本试验后续试验中平板计数用培养基皆为营养琼脂固体培养基，37℃下常规培养。
1.2耐胆盐试验：试验设4个胆盐处理(0.1％、0.2％、0.3％、0.4％(w/V))，以不加胆盐(0％)的培养基为对照。在各处理组及对照组培养液中分别按照0.1%的接种量分别接种枯草芽孢杆菌菌粉。在培养初始及接种后1h、2h、3h、4h、5h取上述对照及各处理中培养菌液，80℃水浴加热10min，进行平板芽孢计数。1.3耐高温试验：在0.9％生理盐水中接种5％已活化的菌种，37℃条件下培养3～4h后，取菌液进行以下热处理：100℃2min、5min、10min，90℃5min、10min、15min，80℃5min、10min、15min。以未经热处理的菌液作为对照，80℃水浴加热10min，进行平板芽孢计数。
2、净水试验
将金百合生物1600亿枯草菌粉经2.5%红糖水37℃活化24h后，以1.5×104CFU/mL的终浓度加入鲈鱼鱼缸水中，试验期间保持水体不更换，每天饲喂1次，。实验持续10d，每间隔1天需水样检测COD、氮、磷、硫含量。同时设置不加枯草菌粉对照组。
3、抑菌试验
将产气荚膜梭菌接种于梭菌强化琼脂培养基中，37℃过夜培养，取10ml生理盐水加入培养好的平板中洗脱产气荚膜梭菌，取培养液备用。于超净工作台中制作强化梭菌琼脂平板，待平板冷却后用无菌棉签蘸取梭菌指示菌均匀涂布于平板上，然后用1mL枪头（外径：9mm）在平板上打孔，火焰封底备用。吸取150μL待检样液加入到相应孔内。将加过样液的培养皿放入4℃的冰箱中扩散3-4h后移入37℃培养箱中培养6-8h。测量记录平板中的抑菌圈直径，判断待测样品的抑菌效果。
1、耐人工胃酸试验结果
表1 不同pH值模拟胃酸中枯草BK5存活情况
实验结果表明，pH1.5-4.5人工胃酸对枯草BK5的存活无太大影响，在pH4.5时，其活菌数随时间延长不断上升，菌株呈正常生长态势，在pH3.5时，在整个处理期间，活菌数基本无变化，说明pH3.5、pH4.5对BK5菌株存活无抑制；在pH1.5和pH2.5时，随时间延长，活菌数有所下降，但在150min时存活数仍较高。在pH1.5时，经枯草BK5菌粉对pH1.5-4.5的人工胃酸有很强的耐受作用。
2、耐胆盐试验结果
表2 不同浓度胆盐中枯草BK5存活情况
试验结果表明，枯草BK5在0.1-0.3%的胆盐中经过4h互相作用，仍然能保持较高的芽孢数，说明枯草BK5对0.1-0.3%的胆盐浓度有较高的耐受能力。
3、耐高温试验结果
表3 枯草BK5耐高温特性
试验结果表明，枯草BK5在100℃和90℃水浴中经10min水浴作用，仍然有89%的存活率，且在90℃条件水浴10min仍有89%的存活率，说明枯草BK5对80-100℃高温环境有较高的耐受能力。
4、净水试验结果
表4 枯草BK5净水特性
结果表明，枯草BK5在实际水产养殖试验中对养殖水体中COD、氮、磷、硫降解率均在80%以上，在试验10d内，试验养殖水体中COD、氮、磷、硫含量均呈大幅稳定下降趋势。因此，枯草BK5对水体COD、氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐具有良好的降解作用。
5、抑菌试验结果
表5 不同厂家竞品抑菌圈直径对比
以上结果表明，枯草BK5对6种病原菌有较强的抑制作用，其中FK5是BK5经复壮后保存的菌株，仍为同一菌株。本实验中单独评估FK5对产气荚膜梭菌有无抑制作用，结果表明，FK5对产气荚膜梭菌产生明显的抑制作用。
枯草芽孢杆菌BK5对pH1.5-4.5人工胃酸、0.1-0.3%的胆盐和80-90℃高温具有较强的耐受作用，同时枯草BK5对水体COD、氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐具有良好的降解作用。同时，枯草BK5对嗜水气单胞菌、大肠杆菌、副溶血弧菌、金葡菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌均有明显的抑制作用。
金百合生物简介：
金百合生物成立于2013年，是一家专注于丁酸梭菌及其衍生物研发、生产、销售为一体的高新技术企业。公司多年来围绕着生物技术领域，致力于发酵微生态制剂的研发，依托农业部微生物产品质量监督检验测试中心、农业微生物学国家重点实验室等科研平台，搭建了高稳丁酸梭菌、功能性丁酸梭菌、丁酸梭菌培养物等技术研究应用推广平台。
金百合生物定位于“做最具价值的微生态”，提出了“设计有价值的模式、制造有价值的产品、提供有价值的服务”为全新的经营理念。以“让微生态为养殖提供价值”为指导思想，让微生态的价值看得见、算得出、摸得着。已荣获国家专精特新“小巨人”、国家高新技术企业、河南省制造业单项冠军企业、河南省“瞪羚”企业、河南省科技小巨人培育企业等荣誉称号。
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